1. 感受态细胞制备:

1)从保藏的甘油管(-40℃)挑取大肠杆菌DH5α划线于LB平板上,在37恒温培养过夜(16-18h)

2)挑取单菌落于50mL LB培养基中37200 r/min培养3-4h,至出现薄雾状菌悬液即可。

3)将培养液置于冰上预冷15min,并间断轻轻摇动。

4)将冷却的培养液倒入己在冰上预冷的50mL离心管中。

5)在冷冻离心机中离心,4 3000r/min 5min

6)弃上清、加入15mL冰上预冷的0.1mol/L CaCL2溶液,轻轻旋转,使细胞充分重新悬浮,冰上放置20-30min

7)43000r/min离心5min

8)弃上清,加入2mL冰上预冷的0.1mol/LCaCl2溶液,轻轻旋转,使细胞充分重新悬浮,5min后就可以用于转化实验,或添加保护剂,低温或超低温冷冻贮藏备用。2. 质粒转化:

1)取出制备好的感受态细胞,迅速融化放在冰上。

2)将感受态细胞分装成200μL/1.5mL离心管,每人3管,分别做阳性对照(加入5μL pKS质粒DNA),阴性对照(加超纯水5μL)和酶连产物转化(酶连产物520μL),用微量移液器轻轻吸打均匀、在冰上放置30min

3)热击
将离心管放置42水浴60-90s(勿动离心管)

4)冰浴
快速将离心管转移到冰上,放置l-2min(时间不能太长)

5)复苏
每管加800μLSOC培养基,在37 200r/min振荡培养50-60min,使细菌复苏,抗性得以表达。

6)涂皿
将三种不同处理各取100μL 左右转化液徐布在含有4μL IPTG40μL x-ga1和氨苄青霉素(Amp 50μg/mL)的平板上。

7)倒置平板于37培养16-18h,观察实验结果并记录结果。3. 注意事项

(1)主要的转化操作都是无菌操作,并且在冰上进行。

(2)配制药品、培养基等均用超纯水。

(3)使用的器皿一定要清洗干净,因为痕量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。

(4)菌体的浓度是影响感受态效率高低的主要因素,适于本法的菌体浓度应在OD6000.05-0.11之间,一般转化效率可以达到107/mg质粒DNA(pUC系列和pKS)